Budapest University of Technology and Economics, Faculty of Electrical Engineering and Informatics

A genetikai információ tárolása, kifejeződése, a laboratóriumi géntechnológiák ismertetése. A biotechnológia molekuláris biológiai alapjainak elsajátítása.

1. Nukleinsavak szerkezete.

A genetikai információ tárolása és kifejezõdése. A nukleotidok  és a nukleinsav lánc szerkezete, polaritás, 3' 5' vég fogalma, a szekvencia jelölése, a DNS szerkezete, a komplementer láncokat összetartó kötések, a DNS denaturációja és a  hibridizáció fogalma, DNS topoizomerek. Az  RNS szerkezete, mRNS, tRNS, rRNS szerkezete. A prokarióta genom, az eukarióta genom és a vírus genom fogalma. Az információ áramlásának iránya, a gén fogalma, a genetikai kód, illetve a kodon fogalma.

2. A DNS replikációja.

A DNS replikációja prokariótákban, a replikáció elve. DNS dependens DNS polimerázok mûködése, templát, primer fogalma, a proof  reading, a nick és a DNS ligáz által katalizált reakció. A cirkuláris prokarióta genom replikációja, a replikációs origo, a replikáció iránya, illetve a két lánc szintézisének iránya, Okazaki fragmentumok, a plazmidok fogalma. A DNS replikációja eukarióta sejtekben. Az eukarióta kromoszóma szervezõdése. DNS polimerázok, telomeráz. A DNS szintézis és a hiszton szintézis idõpontja a sejtciklusban, a hisztonok megoszlása.

3. A DNS károsodásainak javítása repair mechanizmusok, mutációk.

A DNS leggyakoribb kémiai károsodásai, a bázisok dezaminációja, depurinizáció. Timin dimérek kialakulása. Timin-uracil helyett, biztonsági szerepe a DNS-ben. DNS károsodások javításának mechanizmusai, a repair rendszerek kapacitásának határa, a mismatch repair. A kijavítatlan károsodások rögzülése, mutációk. A pontmutációk kialakulásának mechanizmusa, a spontán mutáció mechanizmusa, a pontmutációk következményei kódoló DNS szakaszon, a frame shift illetve a nonsense mutáció fogalma. A mutációk következményei csírasejtekben és szomatikus sejtekben, szuppresszor mutáció, Ames próba. Protoonkogének és tumor szuppresszor gének fogalma.

4. RNS, és a transzkripció.

A gén és a transzkripció prokariótákban. A DNS-dependens RNS polimeráz mûködése, a gén orientációja a kódoló, sense (+) DNS - lánc és a templát (-) DNS-lánc fogalma, a prokarióta transzkripciós egység, a promoter (erõs, gyenge) fogalma, az operon fogalma, a lac-operon és a lac promoter szerkezete, a prokarióta mRNS szerkezete. A transzkripció és az RNS poszt-transzkripciós módosulásai eukariótákban. Az eukarióta DNS jellegzetességei, az eukarióta gén exon - intron szerkezete. Az eukarióta transzkripciós egység, az eukarióta RNS polimerázok. Az eukarióta promóterek, enhancerek és silencerek, a heteronukleáris RNS fogalma. Az mRNS érése, az 5' - cap, a 3' - poliA farok kialakulása és a splicing mechanizmusa. Az eukarióta mRNS szerkezete, az alternatív splicing.

5. A génkifejezõdés szabályozása, transzkripciós faktorok, a sejtciklus szabályozása.

A transzkripció szabályozása prokariótákban, regulátor fehérjék, cisz és transz regulátor elemek. A laktóz (lac) -operon működésének negatív és pozitív szabályozása. Sztringens kontroll és  a prokarióta riboszóma RNS transzkripciója. A transzkripció szabályozása eukariótákban. A transzkripció iniciációjának szabályozása, általános és specifikus transzkripciós faktorok. Protoonkogének és tumor szuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sejtciklus szabályozásában. A sejtciklus kontrol pontjai a Gl/S és a G2/M  fázisok határán. Ciklinek és ciklin dependens protein kinázok. Magi (szteroid, tiroid) receptor géncsaládhoz tartozó transzkripciós faktorok.

6. A vírusgenom replikációja és az onkogének.

A vírusgenom, a fágok replikációjának lítikus és lizogén útja, a fág represszor. Az állati vírusok replikációja. A DNS genommal rendelkezõ virusok. A kettõs szálú RNS megjelenésének szerepe az interferonok hatásmechanizmusában. Az állati vírusok csoportosítása replikációs mechanizmusuk szerint. A retrovírusok replikációja, a reverz transzkriptáz. RNS dependens DNS polimeráz. Onkogéneket hordozó retrovírusok és a celluláris protoonkogének.

7. Fehérjeszintézis.

A transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa. Kódszótár, a transzlációs apparátus komponensei. A transzlációhoz szükséges sejtorganellumok és makromolekulák. A tRNS szerkezet és funkció kapcsolata, aminoacil-tRNS szintetázok. mRNS, kodon-antikodon kapcsolat, a lötyögés biológiai jelentõsége. Prokarióta és eukarióta riboszómák szerkezete és kötõhelyei. A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa. A transzláció folyamata prokariótákban és eukariótákban, a riboszóma ciklus, tRNS töltés, tRNS kötés, iniciáció, elongáció, peptid kötés kialakulása, terminálás. A transzláció szabályozása, eIF2  foszforilációja. A fehérje szintézist gátló antibiotikumok hatásmechanizmusa. A fehérjék sejtorganellumokba  irányítása és a transzláció utáni módosulások. Szekréciós fehérjék szintézise és transzportja az ER membránban. Glikoprotein szintézis.

8. Molekuláris biológiai módszerek.

A genom szervezõdésének fõbb elvei: méret és genetikai információ tartalom (prokariótáktól az emlõsökig), eukarióta genom - repetitív és non-repetitív szekvenciák – DNS reasszociációs kísérletek - szatellita DNS, non-repetitív gének - struktúrgének - az expresszió mértéke és variabilitása emlõs szövetekben, megszakított gének: exonok és intronok jelentõsége, géncsaládok, szupergéncsaládok, génclusterek, genom változékonysága - genetikai rekombináció, integráció, mobil genetikai elemek, géntérkép - HUGO program, gén-adatbank.

9. Rekombináns géntechnológia.

Alapvetõ módszerek: DNS fragmentek izolálása, szekvenálása, azonositása. Restrikciós enzimek, restrikciós endonukleázok gyakorlati jelentõsége. DNS fragmentek elektroforézise - Restrikciós térképek. DNS szekvencia meghatározási módszerek. Hibridizáció – Southern blot, Northern blot, (Western blot), in situ hibridizáció, (immunhisztokémia). Restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus – orvosi, igazságügyi orvostani alkalmazása.

10. Vektorok.

Rekombináns DNS vektorok - plazmid, fág, cosmid, YAC, expressziós vektorok. Vektor tervezés - példák: klónozás - szelekciót optimalizáló módszerek. Expressziós vektorok - prokarióta, eukarióta, - konstitutív, regulálható expressziós vektorok. Géntranszfer - genetikailag módosított vírusok.

11. Könyvtárak.

Genom könyvtár: készítése, felhasználása – kromoszóma séta, génkeresés ("screenelés"), gén struktúra vizsgálatok (regulátor szekvenciák, exon-intron szekvenciák). cDNS könyvtár: készítése, felhasználása, teljes fehérje szekvencia megfejtése.

12.Génamplifikációs eljárások.

A polimeráz láncreakció elve, optimalizálása. RT-PCR. Allél-specifikus PCR. A PCR orvosi alkalmazása  - virológia, prenatalis diagnózis mutációk kimutatására.

13. Génreguláció vizsgálata (transzkripciós szabályozás).

A promoter vizsgálata - DNA footprinting. DNS fehérje kapcsolat vizsgálata - gélretardáció, riporter gének. Funkció vizsgálatok – site directed mutagenezis. Gyakorló példák az eddigi információkból. (Mol. Biol. gyakorlat.)

14. A rekombináns géntechnológia gyakorlati alkalmazásai.

Géndiagnosztika: Betegség gének megtalálása (cisztikus fibrózis). Ismert genetikai mutációk, vírus nukleinsavak kimutatása (RFLP, PCR). DNS chip. Génterápia: Antiszensz RNS. Génbevitel - elõnyei, hátrányai (ADA, TNF).

Transzgenikus és knock-out állatok. Géntechnológia: Mezõgazdaság - kártevõ rezisztens fajták kialakítása (génbevitel Agrobaktériummal). Gyógyászat- rekombináns géntechnológiával elõállított biológiai aktív anyagok (inzulin, véralvadási faktorok, antikoagulánsok, interferonok, interleukinek monoklónális antitestek, vakcinák).

            előadás

a.              A szorgalmi időszakban: Az előadások látogatása kötelező. Azon hallgatók, akik 3-nál többször mulasztottak, "nem felelt meg" minősítést kapnak, amely félévismétlést jelent.

b.       A vizsgaidőszakban: A hallgatók a félév végén biokémia kollokviumot tesznek. A vizsgaszóban történik. A vizsga anyaga a félév teljes előadási anyaga.

Tankönyv: Ádám-Dux-Faragó-Fésűs-Machovich-Mandl-Sümegi:

Orvosi biokémia (szerkesztette: Ádám Veronika), Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2001