A genetikai információ tárolása, kifejeződése, a laboratóriumi géntechnológiák ismertetése. A biotechnológia molekuláris biológiai alapjainak elsajátítása.

1. Nukleinsavak szerkezete.

A genetikai információ tárolása és kifejeződése. Géncsaládok, szupergéncsaládok, génclusterek, genom változékonysága, szatellita DNS, non-repetitív gének – struktúrgének. A nukleotidok és a nukleinsav lánc szerkezete, polaritás, 3' 5' vég fogalma, a szekvencia jelölése, a DNS szerkezete, a komplementer láncokat összetartó kötések, a DNS denaturációja és a hibridizáció fogalma, DNS topoizomerek. Az RNS szerkezete, mRNS, tRNS, rRNS szerkezete. A prokarióta genom, az eukarióta genom és a vírus genom fogalma. Az információ áramlásának iránya, a gén fogalma, a genetikai kód, illetve a kodon fogalma.

2. A DNS replikációja.

A DNS replikációja prokariótákban, a replikáció elve. DNS dependens DNS polimerázok működése, templát, primer fogalma, a proofreading, a nick és a DNS ligáz által katalizált reakció. A cirkuláris prokarióta genom replikációja, a replikációs origo, a replikáció iránya, illetve a két lánc szintézisének iránya, Okazaki fragmentumok, a plazmidok fogalma. A DNS replikációja eukarióta sejtekben. Az eukarióta kromoszóma szervezõdése. DNS polimerázok, telomeráz. A DNS szintézis és a hiszton szintézis időpontja a sejtciklusban, a hisztonok megoszlása.

3. A DNS károsodásainak javítása, repair mechanizmusok, mutációk.

A DNS leggyakoribb kémiai károsodásai, a bázisok dezaminációja, depurinizáció. Timin dimérek kialakulása. Timin-uracil helyett, biztonsági szerepe a DNS-ben. DNS károsodások javításának mechanizmusai, a repair rendszerek kapacitásának határa, a mismatch repair. A kijavítatlan károsodások rögzülése, mutációk. A pontmutációk kialakulásának mechanizmusa, a spontán mutáció mechanizmusa, a pontmutációk következményei kódoló DNS szakaszon, a frame shift illetve a nonsense mutáció fogalma. A mutációk következményei csírasejtekben és szomatikus sejtekben, szuppresszor mutáció, Ames próba. Protoonkogének és tumor szuppresszor gének fogalma.

4. RNS, és a transzkripció.

A gén és a transzkripció prokariótákban. A DNS-dependens RNS polimeráz működése, a gén orientációja a kódoló, sense (+) DNS - lánc és a templát (-) DNS-lánc fogalma, a prokarióta transzkripciós egység, a promoter (erős, gyenge) fogalma, az operon fogalma, a lac-operon és a lac promoter szerkezete, a prokarióta mRNS szerkezete. A transzkripció és az RNS poszt-transzkripciós módosulásai eukariótákban. Az eukarióta DNS jellegzetességei, az eukarióta gén exon - intron szerkezete. Az expresszió mértéke és variabilitása emlős szövetekben, megszakított gének. Az eukarióta transzkripciós egység, az eukarióta RNS polimerázok. Az eukarióta promóterek, enhancerek és silencerek, a heteronukleáris RNS fogalma. Az mRNS érése, az 5' - cap, a 3' - poliA farok kialakulása és a splicing mechanizmusa. Az eukarióta mRNS szerkezete, az alternatív splicing.

5. A génkifejeződés szabályozása, transzkripciós faktorok, a sejtciklus szabályozása.

A transzkripció szabályozása prokariótákban, regulátor fehérjék, cisz és transz regulátor elemek. A laktóz (lac) -operon működésének negatív és pozitív szabályozása. Sztringens kontroll és a prokarióta riboszóma RNS transzkripciója. A transzkripció szabályozása eukariótákban. A transzkripció iniciációjának szabályozása, általános és specifikus transzkripciós faktorok. Protoonkogének és tumor szuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sejtciklus szabályozásában. A sejtciklus kontrol pontjai a Gl/S és a G2/M fázisok határán. Ciklinek és ciklin dependens protein kinázok. Magi (szteroid, tiroid) receptor géncsaládhoz tartozó transzkripciós faktorok.

6. A vírusgenom replikációja és az onkogének.

A vírusgenom, a fágok replikációjának lítikus és lizogén útja, a fág represszor. Az állati vírusok replikációja. A DNS genommal rendelkező vírusok. A kettős szálú RNS megjelenésének szerepe az interferonok hatásmechanizmusában. Az állati vírusok csoportosítása replikációs mechanizmusuk szerint. A retrovírusok replikációja, a reverz transzkriptáz. RNS dependens DNS polimeráz. Onkogéneket hordozó retrovírusok és a celluláris protoonkogének.

7. Fehérjeszintézis.

A transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa. Kódszótár, a transzlációs apparátus komponensei. A transzlációhoz szükséges sejtorganellumok és makromolekulák. A tRNS szerkezet és funkció kapcsolata, aminoacil-tRNS szintetázok. mRNS, kodon-antikodon kapcsolat, a lötyögés biológiai jelentősége. Prokarióta és eukarióta riboszómák szerkezete és kötőhelyei. A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa. A transzláció folyamata prokariótákban és eukariótákban, a riboszóma ciklus, tRNS töltés, tRNS kötés, iniciáció, elongáció, peptid kötés kialakulása, terminálás. A transzláció szabályozása, eIF2 foszforilációja. A fehérje szintézist gátló antibiotikumok hatásmechanizmusa. A fehérjék sejtorganellumokba irányítása és a transzláció utáni módosulások. Szekréciós fehérjék szintézise és transzportja az ER membránban. Glikoprotein szintézis.

8. Molekuláris biológiai és egyéb biológiai laboratóriumi módszerek.

Fizikai-kémiai és biológiai alapú elválasztási módszerek (elektroforézis, kromatográfia) alapelvei. Az enzimdiagnosztika alapjai. Makromolekulák szintézisének mérése jelzett prekurzorokkal. Immunológiai analitikai módszerek (ELISA).

9. Rekombináns géntechnológia.

Alapvető módszerek: DNS fragmentek izolálása, szekvenálása, azonosítása. Restrikciós enzimek, restrikciós endonukleázok gyakorlati jelentősége. DNS fragmentek elektroforézise - Restrikciós térképek. DNS szekvencia meghatározási módszerek. Hibridizáció – Southern blot, Northern blot, (Western blot), in situ hibridizáció, (immunhisztokémia). Genetikai rekombináció, integráció, mobil genetikai elemek, géntérkép.

10. Vektorok és könyvtárak.

Rekombináns DNS vektorok - plazmid, fág, cosmid, YAC, expressziós vektorok. Vektor tervezés - példák: klónozás - szelekciót optimalizáló módszerek. Expressziós vektorok - prokarióta, eukarióta, - konstitutív, regulálható expressziós vektorok. Géntranszfer - genetikailag módosított vírusok.

07Genom könyvtár: készítése, felhasználása – kromoszóma séta, génkeresés ("screenelés"), gén struktúra vizsgálatok (regulátor szekvenciák, exon-intron szekvenciák). cDNS könyvtár: készítése, felhasználása, teljes fehérje szekvencia megfejtése. A Humán Genom Project program, gén-adatbank.

11. Génamplifikációs eljárások.

A polimeráz láncreakció elve, optimalizálása. RT-PCR. Allél-specifikus PCR. Restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus – orvosi, igazságügyi orvostani alkalmazása. A PCR orvosi alkalmazása - virológia, prenatalis diagnózis mutációk kimutatására.

12. Génreguláció vizsgálata (transzkripciós szabályozás).

A promoter vizsgálata - DNA footprinting. DNS fehérje kapcsolat vizsgálata - gélretardáció, riporter gének. Funkció vizsgálatok – irányított mutagenezis. Gyakorló példák az eddigi információkból. (Mol. Biol. gyakorlat.)

13. A rekombináns géntechnológia gyakorlati alkalmazásai.

Géndiagnosztika: Betegségre jellemző gének megtalálása (cisztikus fibrózis). Ismert genetikai mutációk, vírus nukleinsavak kimutatása (RFLP, PCR). DNS chip. Génterápia: Antiszensz RNS. Génbevitel - előnyei, hátrányai (ADA, TIL).

Transzgenikus és knock-out állatok. A géntechnológia gyógyászati alkalmazása: rekombináns géntechnológiával előállított biológiai aktív anyagok (inzulin, véralvadási faktorok, antikoagulánsok, interferonok, interleukinek, monoklonális antitestek, vakcinák). A génmódosított élelmiszerek problémája – előállításuk, egészségügyi, ökológiai és gazdasági veszélyek, a génmanipuláció törvényi korlátozása.

14. Bioinformatika. Az in silico vizsgálatok alapjai.

DNS és fehérje szekvencia adatbankok. Az adatbankok használata. Egy baktérium (Mycobacterium tuberculosis) PCR-azonosításához szükséges primer megtervezése DNS-adatbank segítségével. Az alvadási zavarok egyik típusában szerepet játszó Leiden-mutáció PCR-kimutatásához szükséges primer megtervezése. Két izoenzim (vagy két bármely fehérje) homológiájának vizsgálata fehérje-szekvencia adatbank felhasználásával.

Előadás és gyakorlat.

A szorgalmi időszakban: Az előadások látogatása kötelező. Azon hallgatók, akik 4-nél többször mulasztottak, „nem teljesítette” minősítést kapnak, a vizsgán nem vehetnek részt.

A vizsgaidőszakban: szóbeli vizsga

Elővizsga: --

Szükség szerint, megbeszélés alapján.

Ádám-Dux-Faragó-Fésűs-Machovich-Mandl-Sümegi: Orvosi biokémia (szerkesztette: Ádám Veronika), Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2001

Dr. Mandl József egyetemi tanár SE Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet

Dr. Csuka Ildikó egyetemi adjunktus SE OVMBPI

Dr. Hrabák András egyetemi docens SE OVMBPI